单细胞+CRISPR技术解密膀胱癌发生的分子机制

每一个癌细胞曾经都是一个健康细胞。它们逐渐演变成大家恐惧的癌症，背后都有着不为人知的故事。

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首先简单的了解一下癌症。现代生物学理论认为，癌症是基因引起的疾病，是当调控细胞生长的基因发生突变或损坏时，导致细胞失去控制，持续的生长及分裂，进而产生的一种疾病。

通俗地说，就是一个正常细胞，受到了各种刺激（威逼利诱）后，开始了“Ctrl+C→Ctrl+V→Ctrl+A→Ctrl+C→Ctrl+V→Ctrl+A→Ctrl+C→Ctrl+V→ …… ”的无限重复过程，形成了一大团无组织、无纪律的细胞，这种细胞的共同特点是严重的异常增生。

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那膀胱正常细胞，是怎么在成长的过程中误入歧途，就发展成了膀胱癌细胞呢？目前研究表明，有一种细胞，是膀胱黏膜上皮细胞，这种细胞爱多变，喜欢标新立异。同样是细胞增殖过程，膀胱黏膜上皮细胞更容易误入歧途，出现变质增生，这种异常的变质增生逐渐形成一种常态，这种常态被称之为“癌变”，癌变之后的细胞会扩散到膀胱壁的肌肉内层，继而形成癌症。

为了弄清楚这里面千丝万缕的因果关系，华大基因与深圳大学附属罗湖医院合作发表的文章中^[1]，对53个膀胱癌细胞和上皮细胞进行单细胞外显子组测序。在单细胞的水平上，对每一个细胞进行测序，逐一排查，可以不漏掉任何一个潜在的“嫌疑犯”。

首先来梳理一下这些细胞之间的关系：

假设膀胱癌细胞（BCSC）是我们最终要抓拿的“凶手”，那我们把犯罪嫌疑人进行一一梳理，那这些细胞之间的关系可以参照以下，理解为：

BESC（膀胱上皮干细胞）：假定为 “头号嫌疑犯”。

BCNSC（膀胱癌非干细胞）：假定为“二号嫌疑犯”。

BENSC（膀胱上皮非干细胞）：它的嫌疑程度最低，暂且假定为“路人甲”。

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为了逐个排查，文章进行单个细胞测序，分别对以下四种类型细胞进行测序： BCSCs（膀胱癌干细胞）、BCNSCs（膀胱癌非干细胞）、BESCs（膀胱上皮干细胞）、BENSCs（膀胱上皮非干细胞）。

[1]使用邻接法，通过测得的SNP/SNV多态性突变位点，构建了系统发育树。用树状的图的形式，可以更直观地反馈不同细胞演化关系。

以下P1、P3的亲缘关系图可以看到：膀胱癌干细胞（BCSC）与膀胱上皮细胞（BESC）的距离是最近的，反映了膀胱癌细胞极有可能是源自膀胱上皮细胞的突变而导致的（找到头号嫌疑犯）。

P2的亲缘关系可以看到：膀胱癌干细胞（BCSC）与膀胱癌非干细胞（BCNSC）的距离是最近的，反映了膀胱癌细胞极也可能是源自膀胱癌非干细胞的突变而导致的（找到二号嫌疑犯）。

图1 利用单细胞外显子组测得的SNP/SNV突变点，使用邻接法构建的系统发生树

图中，BCSCs（橙色）代表膀胱癌干细胞，BCNSCs（黄色）代表膀胱癌非干细胞，BESCs（蓝色）代表膀胱上皮干细胞，BENSCs（绿色）代表膀胱上皮非干细胞。

[2]对突变点进行深入分析，发现分布在5个功能通路上的21个主要的突变基因。

这21个主要基因中，6个基因(下图2带“*”号：ETS1, GPRC5A, MKL1, PAWR, PITX2 and RGS9BP)是新发现的，从前并未被报道与膀胱癌相关。

图2 主要基因的体细胞突变分析结果

红色为非同义突变，绿色部分为同义突变。

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为了避免“冤假错案”，文章结合了目前最热门的被誉为“人类掌握了上帝的技术”的CRISPR技术，对结果进行了验证。于是，就把上述找到的嫌疑位点一一叠加，通过基因编辑技术导入细胞，发现当这几个非同义突变：ARIDA1+GPRC5A+MLL2组合在一起的时候，致癌作用明显增强。以下BCNSCs Mut为突变型，是通过CRISPR把ARIDA1+GPRC5A+MLL2突变组合放入膀胱癌非干细胞里面，生成突变株以及BBCNSCs WT野生株。

在CRISPR技术的验证下，结果显而易见：

图3A可以看到突变型感染的免疫缺陷小鼠的肿瘤体积明显出现增大；’ 

图3B显示在不同突变株小鼠的移植瘤体积大小，其中也是突变株的移植瘤明显大于野生型的。

图3：ARID1A, GPRC5A ,MLL2 突变增强了BCNSCs肿瘤的形成

故事有了结果，但并不是结局。我们期待这个发现可以为后续癌症治疗的药物开发带来更好的指导作用和协助膀胱癌的临床治疗，相信这才是故事最好的结局。

参考文献

[1]. Yang Z, Li C, Liu H, et al. Single-cell sequencing reveals variants in ARID1A, GPRC5A and MLL2 driving self-renewal of human bladder cancer stem cells [J]. European Urology, 2016.

撰稿：吴蔚瑶

编辑：市场部

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